LAPORAN KULTUR JARINGAN STERILISASI RUANG, ALAT, DAN MEDIA KULTUR IN VITRO

LAPORAN PRAKTIKUM

TEKNIK KULTUR JARINGAN

“STERILISASI RUANG, ALAT, DAN MEDIA KULTUR IN VITRO”

    OLEH :

NAMA       : PETRUS SIMATUPANG  

NPM           : E1J009094

CO.ASS     : RUTH SIREGAR

PRODI AGROEKOTEKNOLOGI

FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS BENGKULU

2012

BAB I

PENDAHULUAN

A.      Dasar  Teori

Umumnya penggunaan operasional di lab perbanyakan tanaman dengan kultur jaringan dapat dipelajari dengan mudah. Hal yang paling perlu diperhatikan adalah akurasi, kebersihan dan keamanan saat bekerja dengan teknik kultur jaringan. Penimbangan Pada saat pembuatan media, semua bahan yang ditimbang harus dilakukan dengan hati-hati meskipun untuk pembuatan media dalam skala komersial. Setiap penggunaan timbangan atau alat-alat lain harus memperhatikan instruksi dari pabrikannya.

Jenis timbangan yang sering digunakan di lab antara lain top-loading balance dan analytical balance yang memungkinkan akurasi penimbangan hingga skala milligram. Beberapa persyaratan yang harus diperhatikan agar diperoleh penimbangan yang akurat adalah (i) timbangan harus ditempatkan pada tempat yang keras, stabil, permukaannya rata yang bebas getaran dan kebocoran, (ii) daerah sekitar penimbangan harus terjaga kebersihannya, (iii) yang terpenting lagi, penimbangan jangan sampai pernah overload, (iv) penimbangan disarankan menggunakan wadah atau alas yang ringan atau kertas daripada menempatkan bahan yang ditimbang secara langsung di atas piring timbangan.

Pengukuran cairan/larutan Peralatan gelas yang mempunyai ukuran seperti gelas piala, erlenmeyer dan pipet diperlukan untuk pembuatan media. Gelas ukur kapasitas 10, 25, 100 dan 1000 ml banyak digunakan untuk mengukur volume, tetapi pengukuran yang lebih akurat diperlukan labu ukur dan pipet. Pengukuran larutan dengan menggunakan pipet dan labu ukur hanya akan akurat apabila bagian dasar dari cekungan antara air dan udara berada tepat pada tanda pengukuran. Penggunaan pipet harus dibantu dengan alat penghisap larutan (pipetor). Jangan pernah menggunakan mulut untuk memipet. Jenis-jenis pipetor yang umum digunakan antara lain (i) tipe bola penghisap yang dilengkapi dengan beberapa katup pengontrol, (ii) pipet penghisap yang dioperasikan menggunakan roda kecil pada bagian atas alat penghisap, (iii) alat penghisap dengan bantuan pompa udara secara elektrik. Cairan dihisap kedalam pipet dengan menekan tombol bagian atas dan melepaskan cairan dengan menekan tombol bagian bawah, (iv) pipet mikro, biasanya untuk pengambilan larutan dengan volume yang sangat kecil (mikro liter).

Membersihkan peralatan gelas Metoda konvensional pencucian peralatan gelas dilakukan dengan merendam gelas dalam larutan asam kromat yang diikuti pembilasan dengan air kran dan air destilasi. Karena asam kromat dapat menyebabkan korosif, maka cara ini banyak ditinggalkan kecuali untuk peralatan gelas yang terkontaminasi tinggi. Pencucian yang lebih aman adalah dengan air panas (>70oC) + sabun, diikuti dengan pembilasan dengan air panas dan air destilasi. Peralatan gelas yang telah dicuci, dikeringkan dalam oven pada suhu 150oC dibungkus dengan aluminium foil, kemudian disimpan dalam lemari tertutup.

B.       Tujuan

Memberikan pengetahuan dan ketrampilan pada mahasiswa agar mahasiswa terampil melakukan sterilisasi ruang, peralatan dan media yang digunakan dalam kultur jaringan.
BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Sterilisasi Bagian yang sangat penting dalam teknik in vitro adalah sterilisasi bahan tanaman dan media dan menjaga kondisi aseptik yang telah dicapai. Bakteri dan jamur adalah dua kontaminan yang paling banyak dijumpai dalam kultur. Spora jamur sangat ringan dan ada disekeliling lingkungan. Apabila spora jamur kontak dengan media kultur dan kondisinya optimal untuk perkecambahan jamur, maka akan terjadi kontaminasi.

a.       Sterilisasi Ruang Kultur dan Transfer

Sterilisasi ruang kultur yang paling baik adalah dilakukan dengan penggunaan sinar ultraviolet (UV). Waktu sterilisasi bervariasi tergantung dari ukuran ruang transfer itu sendiri dan harus dilakukan apabila tidak ada kegiatan dalam ruang tersebut. Radiasi UV sangat berbahaya bagi mata dan kulit. Ruang transfer dapat juga disterilisasi dengan mencuci/mengepel 1-2 kali setiap bulan dengan bahan anti jamur (fungisida) komersial. Ruang kerja dalam laminar flow biasanya sudah dilengkapi dengan lampu UV, sehingga sterilisasinya dilakukan dengan UV dan diikuti dengan membasuh/melap permukaan tempat bekerja dalam laminar dengan alkohol 95% sebelum mulai bekerja. Ruang kultur harus dibersihkan dengan sabun kemudian dilap dengan Na-hypoklorit 2% (merek komersial seperti Sunclin, Bayclin atau pembersih lantai lain yang mengandung disinfektan) atau alkohol 95%. Lantai ruangan dan dinding harus dibesihkan seminggu sekali dengan bahan yang sama.

b.       Sterilisasi Peralatan Gelas dan Peralatan Lain. 

Peralatan yang terbuat dari metal, gelas, aluminium foil, dll., dapat disterilsasi dengan cara pengeringan dalam oven pada suhu 130o-170oC selama 2-4 jam. Semua peralatan tersebut harus dibungkus sebelum di oven, tetapi jangan menggunakan kertas karena akan akan terdekomposisi pada suhu 170oC. Sterilisasi dengan menggunakan autoclave tidak dsarankan untuk bahan yang erbuat dari metal karena akan menyebabkan karat. Untuk peralatan diseksi yang akan digunakan pada ruang transfer atau laminar, setelah disterilisasi dalam oven harus direndam dahulu dalam alkohol 96% kemudian dibakar di atas lampu bunsen. Teknik ini disebut sterilisasi pembakaran (flame sterilization). Teknik ini harus dilakukan dengan ekstra hati-hati karena alkohol sangat mudah terbakar. Autoclave adalah metoda sterilisasi dengan menggunakan tekanan uap air. Bahan-bahan atau alat yang dapat disterilisasi dengan cara autoclave ini antara lain kapas penutup tabung, saringan dari nylon, pakaian lab, tutup plastik, peralatan gelas, pipet, air, dan media kultur. Hampir semua mikroba dapat mati bila diautoclave pada suhu 121oC dengan tekanan 15 psi selama 15-20 menit.

c.        Sterilisasi Media 

Ada dua metoda untuk sterilisasi media yang umum digunakan, yaitu dengan autoclave dan filter membran. Media kultur, air destilasi dan campuran yang stabil dapat disterilisasi dalam autoclave dengan menggunakan wadah yang ditutup dengan kapas, aluminium foil atau plastik. Akan tetapi, larutan dari bahan-bahan yang bersifat tidak stabil (heat-labile) harus menggunakan filter. Umumnya media diautoclave pada tekanan 15 psi dengan suhu 121oC. Untuk volume larutan per wadah yang sedikit (< 100 ml), waktu yang dibutuhkan adalah 15-20 menit, tetapi untuk jumlah yang besar (2-4 liter) selama 30-40 menit. Tekanan jangan melebhi dari 20 psi karena dapat mengakibatkan dekomposisi karbohidrat dan bahan lain dalam media yang bersifat thermolabile.

Beberapa senyawa yang tergolong dalam kelompok protein, vitamin, asam amino, ekstrak tanama, hormon dan karbohidrat ada yang bersifat thermolabile yang mungkin akan mengakibatkan dekomposisi bila disterilisasi dengan autoclave, sehingga harus disterilisasi dengan filter. Filter Millipore yang mempunyai porositas ± 0.2 mikron (µm) merupakan salah satu filter yang banyak digunakan untuk sterilisasi bahan yang bersifat thermolabile. Peralatan gelas yang akan menampung media yang disterilisasi dengan filter harus sudah disterilisasi dahulu dengan autoclave.

Media yang sebagian mengandung komponen thermolabile, dapat dibuat dengan cara: (i) larutan yang mengandung komponen heat-stable disterilisasi dengan autoclave, kemudian didinginkan sampai suhu 50o-60oC pada kondisi steril (biasanya dalam laminar), (ii) pada bagian lain dalam kondisi yang steril, larutan yang mengandung komponen besifat thermolabile disterilisasi dengan filter, (iii) kedua larutan yang sudah disterilisasi dengan metoda yang berbeda tersebut digabungkan dalam kondisi aseptik. d

d.       Sterilisasi Bahan Tanaman 

Mendapatkan bahan tanaman yang steril merupakan hal yang sulit. Meskipun bermacam tindakan pencegahan sudah dilakukan, 95% kultur akan mengalami kontaminasi apabila eksplan tidak didisinfeksi. Organ atau jaringan tanaman harus disterilisasi dengan larutan disinfektan, karena sebagai bahan biologis tidak dapat dilakukan dengan cara pemanasan yang ekstrim.

Tidak ada metoda yang baku untuk sterilisasi eksplan, sehingga waktu perendaman dalam larutan disinfektan merupakan kisaran karena tergantung pada jenis bahan dan tanaman yang akan disterilisasi. Larutan yang digunakan harus yang aman bagi jaringan/eksplan tetapi bersifat dapat membunuh kontaminan baik bakteri maupun jamur. Untuk tanaman berkayu, umbi dll. biasanya sebelum disterilisasi dengan larutan disinfektan harus dibersihkan dahulu dengan sabun dan dibilas dengan air mengalir, tetapi tidak untuk tanaman jenis herbaceous. Semua permukaan eksplan yang disteriliasi harus terendam dalam sterilan, dan setelahnya harus dibilas dengan akuades steril sekurang-kurangnya tiga kali.

           

BAB III

METODE PELAKSANAAN

A.   Bahan dan Alat

-          Autoclave

-          Peralatan gelas kaca/Glass were (botol kultur, petridish, Erlenmeyer)

-          Peralatan penanaman/ Dissecting kit (pinset, gunting, scalpel)

-          Plastik, karet gelang, kertas pembngkus, alumunium foil, plastic seal

-          Bahan kimia formalin

-          Alkohol

B.     Cara Kerja

·         Sterilisasi Lingkungan Kerja

Kebersihan lingkngan kerja secara keseluruhan dilakukan dengan cara membersihkan semua debu dan kotoran yang ada, selanjutnya dilakukan kegiatan fumigasi dengan menggunakan disinfektan ataupun senyawa formalin yang dilakukan secara periodic. Disamping itu, lingkungan kerja terutama pada ruang transfer harus selalu dalam kondisi yang steril dari kontaminan. Pada ruang transfer biasanya dilengkapi dengan laminar air flow (LAC). Proses transfer atau penanaman eksplan dilakukan secara aseptic didalam LAC, karena dilengkapi dengan:

1.      Filter HEPA (High Emergency Particulate Air)

2.      Ultraviolet lamp (UV Lamp)

3.      Blower

·         Sterilisasi Air Dan Media Tanam

1.      Botol yang telah diisi dengan air dan botol kultur yang telah berisi media kultur ditutup rapat dengan menggunakan allumunium disterilisasi dengan menggunakan autoclave pada suhu 121­^o C selama 15 menit pada tekanan 15 psi (pound per square inch)

2.      Selama proses sterilisasi berlangsung, autoclave ditutup rapat sehingga tekanan didalam autoclave naik.

3.      Setelah proses sterilisasi selesai, suhu dan tekanan autoclave kembali ke posisi 0, keluarkan botol kultur dari dalam autoclave

4.      Inkubasi di dalam ruang kultur selama ± 1 minggu

·         Sterilisasi botol kultur yang terkontaminasi:

1.      Botol kultur yang terkontaminasi dikelurkan dari ruang kultur

2.      Sterilisasi langsung dengan menggunakan autoclave pada suhu 121^o C selama 30 menit pada tekanan 15 psi

3.      Selama proses sterilisasi berlangsung, autoclave ditutup rapat sehingga tekanan didalam autoclave naik.

4.      Setelah proses sterilisasi selesai, suhu dan tekanan autoclave kembali ke posisi 0, keluarkan botol kultur dari dalam autoclave

5.      Buang semua sisa media yang terkontaminasi pada tempat yang sudah disiapkan

6.      Rendam dalam larutan sodium hypochlorite (dapat menggnakan byclin) dengan konsentrasi 50% selama minimal 1 jam.

7.      Cuci dengan detergen

8.      Bilas dengan air yang mengalir

9.      Tempatkan di dalam oven pada suhu 70-80^o C. Atau simpan kembali di tempat yang bersih.

·         Sterilisasi Glass Were Dan Dissecting Kit

1.      Cuci bersih glass ware dan dissecting kit yang akan disterillkan.

2.      Bungkus dengan menggunakan allumunium foil atau kertas yang bersih

3.      Autoclave pada suhu 121 C pada tekanan 15 psi selama 30 menit

4.      Suhu autoclave kembali ke posisi 0, keluarkan alat-alat dari autoclave

5.      Simpan dalam oven atau dalam LAC dengan lampu UV tetap menyala.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

Dalam praktikum ini membahas tentang bagaimana melakukan sterilisasi ruang alat dan media kultur, adapun jenis jenis sterilisasi yang digunakan adalah:

-          Sterilisasi lingkungan kerja

-          Sterilisasi air dan media tanam

-          Sterilisasi boltor kultur yang terkontaminan

-          Sterilisasi glass ware dan dissecting kit

 Pada prosedur pelaksanaan sterilisasi ruang dapat melakukan beberapa cara sebagai berikut;

-          Dapat  menhidupkan UV Lamp selama  1 jam

-          Melakukan pembersihan terhadap semua kotoran dan debu

-          Dan dapat juga melakukan kegiata fumigasi dengan larutan disinfectant dan formalin

Adapun bahan kimia yang digunakan untuk sterilisasi ruang adalah formalin, alcohol dan disinfectant.

Selain membahas tentang sterilisasi ruang disini juga akan membahas tentang prosedur sterilisasi alat. Pada peralatan yang terbuat dari metal, gelas, aluminium foil, dll., dapat disterilsasi dengan cara pengeringan dalam oven pada suhu 130^o-170^oC selama 2-4 jam. Semua peralatan tersebut harus dibungkus sebelum di oven, tetapi jangan menggunakan kertas karena akan akan terdekomposisi pada suhu 170oC. Sterilisasi dengan menggunakan autoclave tidak dsarankan untuk bahan yang erbuat dari metal karena akan menyebabkan karat. Untuk peralatan diseksi yang akan digunakan pada ruang transfer atau laminar, setelah disterilisasi dalam oven harus direndam dahulu dalam alkohol 96% kemudian dibakar di atas lampu bunsen. Teknik ini disebut sterilisasi pembakaran (flame sterilization). Teknik ini harus dilakukan dengan ekstra hati-hati karena alkohol sangat mudah terbakar. Autoclave adalah metoda sterilisasi dengan menggunakan tekanan uap air. Bahan-bahan atau alat yang dapat disterilisasi dengan cara autoclave ini antara lain kapas penutup tabung, saringan dari nylon, pakaian lab, tutup plastik, peralatan gelas, pipet, air, dan media kultur. Hampir semua mikroba dapat mati bila diautoclave pada suhu 121oC dengan tekanan 15 psi selama 15-20 menit. Setelah selesai, selanjutnya alat tersebut di masukan ke dalam LAC atau oven.

Pada sterilisasi media dan air dapat menggunakan dua metoda untuk sterilisasi media yang umum digunakan, yaitu dengan autoclave dan filter membran. Media kultur, air destilasi dan campuran yang stabil dapat disterilisasi dalam autoclave dengan menggunakan wadah yang ditutup dengan kapas, aluminium foil atau plastik. Akan tetapi, larutan dari bahan-bahan yang bersifat tidak stabil (heat-labile) harus menggunakan filter. Umumnya media diautoclave pada tekanan 15 psi dengan suhu 121oC. Untuk volume larutan per wadah yang sedikit (< 100 ml), waktu yang dibutuhkan adalah 15-20 menit, tetapi untuk jumlah yang besar (2-4 liter) selama 30-40 menit. Tekanan jangan melebhi dari 20 psi karena dapat mengakibatkan dekomposisi karbohidrat dan bahan lain dalam media yang bersifat thermolabile.

Beberapa senyawa yang tergolong dalam kelompok protein, vitamin, asam amino, ekstrak tanama, hormon dan karbohidrat ada yang bersifat thermolabile yang mungkin akan mengakibatkan dekomposisi bila disterilisasi dengan autoclave, sehingga harus disterilisasi dengan filter. Filter Millipore yang mempunyai porositas ± 0.2 mikron (µm) merupakan salah satu filter yang banyak digunakan untuk sterilisasi bahan yang bersifat thermolabile. Peralatan gelas yang akan menampung media yang disterilisasi dengan filter harus sudah disterilisasi dahulu dengan autoclave.

           

Media yang sebagian mengandung komponen thermolabile, dapat dibuat dengan cara: (i) larutan yang mengandung komponen heat-stable disterilisasi dengan autoclave, kemudian didinginkan sampai suhu 50o-60oC pada kondisi steril (biasanya dalam laminar), (ii) pada bagian lain dalam kondisi yang steril, larutan yang mengandung komponen besifat thermolabile disterilisasi dengan filter, (iii) kedua larutan yang sudah disterilisasi dengan metoda yang berbeda tersebut digabungkan dalam kondisi aseptik.

BAB V

PENUTUP

Kesimpulan:

ü  Sterilisasi perlu dilakukan karena itu adalah hal terpenting untuk keberhasilan dalam kultur jaringan.

ü  adapun jenis jenis sterilisasi yang digunakan adalah:

o   Sterilisasi lingkungan kerja

o   Sterilisasi air dan media tanam

o   Sterilisasi boltor kultur yang terkontaminan

o   Sterilisasi glass ware dan dissecting kit

ü  Dengan menggunakan autoclave, sterilisasi digunskan pada suhu 121­^o C selama 15 menit pada tekanan 15 psi (pound per square inch)

DAFTAR PUSTAKA

Marlin, dkk. 2012. Penuntun Praktikum Kultur Jaringan. Fakultas Pertanian Universitas Bengkulu, Bengkulu.

Nugroho, A dan H. Sugianto. 1997. Pedoman Pelaksanaan Tehnik Kultur Jaringan. Penebar Swadaya, Jakarta.

Wattimena, G. A. 1992. Bioteknologi Tanaman. IPB, Bogor.